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酶标仪测量细胞裂解物中的总蛋白

    

从细胞裂解物中定量蛋白质浓度是许多下游应用的关键步骤,例如蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。两种最流行的测定是比色法,它依赖于在蛋白质存在下试剂的颜色变化。Bradford 蛋白质测定基于考马斯蓝染料从 465 nm(未结合)到 595 nm(结合)的吸光度变化。二辛可宁酸测定 (BCA) 依赖于两个反应:(1) 蛋白质将 Cu 2+还原为 Cu 1+和 (2) 二辛可宁酸与 Cu 1+结合,形成紫色复合物,在 562 nm 处强烈吸收光。

在这里,我们描述了使用 Pierce Rapid Gold BCA 和 Pierce Detergent Compatible Bradford 检测来定量细胞裂解物中的总蛋白。标准 BCA 检测需要在 37°C 下孵育 30 分钟,但 Rapid Gold BCA 检测只需要在室温下孵育 5 分钟,并且在 480 nm 处测量吸光度。去污剂兼容的 Bradford 检测克服了考马斯染料与在含有去污剂的缓冲液中裂解的细胞一起使用时遇到的问题。

两种测定均在  酶标仪上读取。软件中的预配置方案用于获取数据并绘制标准曲线,从中确定细胞裂解物的浓度。Rapid Gold BCA 测定和去污剂兼容的 Bradford 测定都给出了与所用细胞裂解物相似的结果。


材料

Pierce Rapid Gold BCA 蛋白检测试剂盒

Pierce 洗涤剂兼容 Bradford 检测试剂盒

RIPA 缓冲液

Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail

Greiner 透明 96 孔微孔板

CHO-K1 细胞

酶标仪


方法

细胞裂解液制备

从 CHO-K1 细胞的 T-75 烧瓶中吸出培养基,并用 10 mL 含有钙和镁的冷 PBS 洗涤细胞。吸出 PBS 后,向烧瓶中加入 2 mL RIPA 缓冲液,并在室温下孵育细胞 5 分钟以确保完全裂解。将 Halt 蛋白酶抑制剂以 1X 的终浓度添加到裂解物中。将裂解液分开并转移到两个 1.5 mL 微量离心管中,并以 14,000 rpm 离心 20 分钟。在 PBS 中制备一系列 1:3 稀释系列的上清液,以测试测定在一系列细胞和裂解缓冲液浓度范围内的性能。

标准曲线

对于这两种蛋白质检测,根据检测试剂盒说明制备了 25 µg/mL 至 2000 µg/mL 的牛血清白蛋白 (BSA) 标准品。

快速金 BCA 检测

将 20 µL BSA 标准品或细胞裂解液移入 96 孔微孔板(n = 3)的孔中,然后加入 200 µL 工作试剂(50:1 试剂 A:试剂 B)。将板置于振荡器上30秒以混合内容物,然后在室温下不摇动孵育5分钟。在 SpectraMax ABS Plus 读数器上在 480 nm 处读取吸光度。

去污剂兼容 Bradford 检测

将 10 μL 的 BSA 标准品或细胞裂解液移入 96 孔微孔板 (n = 3) 的孔中。将 300 µL 与去垢剂兼容的 Bradford 试剂添加到每个孔中。将孔中的内容物上下吸移几次以混合。将板在室温下孵育 10 分钟,并在 SpectraMax ABS Plus 读数器上在 595 nm 处读数。

数据分析

使用  软件中的二次曲线拟合绘制标准曲线,并通过软件根据标准曲线计算细胞裂解物的浓度。