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用于代谢物分析的滴涂沉积拉曼光谱

    

由于拉曼技术的低效率,人们对提高拉曼光谱的灵敏度很感兴趣。近年来,一种预浓缩技术、滴涂沉积拉曼 (DCDR) 已被用于通过降低非增强拉曼检测的检测限来提高拉曼光谱的效用。

在 DCDR 的典型实施中,小体积(在 μL 到 nL 范围内)的稀释溶液通过在特殊的疏水板上干燥来预浓缩。DCDR 使用咖啡环干燥模式预先浓缩弱拉曼散射体,然后再进行拉曼分析。1检测限的提高是由于干燥时形成浓缩残留物。为了获得 DCDR 的最大效率,基材应具有某些特性,例如高疏溶剂性(对多种溶剂)、低吸光度、高反射率以及与沉积物无背景和非润湿相互作用。2不润湿特性尤其重要,因为必须将环限制在小区域内以形成集中沉积物。润湿的基材会将溶液扩散到更大的区域,从而产生更大的环并导致分析物沉积的密度降低。在这里介绍的研究中,使用了具有这些特性的镀金基材。

已实施 DCDR 以从低浓度蛋白质溶液中获得高质量的非增强拉曼光谱。2张等人。表明干燥过程产生了溶液中溶质的分离。结果表明,当缓冲盐在中心周围蒸发时,蛋白质分子向外移动到边缘并集中在环上。更具体地说,这项工作的结果可以概括为:较大的溶质倾向于沉积在沉积液滴外缘的圆环中,而更多的可溶物质倾向于沉积在中心区域。因此,DCDR 作为拆分混合物中的组分的手段可能是有利的。

Nechaeva等人。使用 DCDR 来提高拉曼技术测定硫代胆碱的灵敏度。3表面增强拉曼光谱 (SERS) 与 DCDR 技术相结合,在 260nM 处获得了检测限 (LOD)。菲力克等人。证明 DCDR 光谱可用于蛋白质混合物的成分分析。4 DCDR 与化学计量学技术相结合,仅使用 1.5 μL 样品体积即可确定相对蛋白质浓度。该小组还分析了人类泪液,以评估 DCDR 检测泪液样本中蛋白质、尿素、碳酸氢盐和脂质成分的能力。5发现这些组分的分布是不均匀的,这可能是由于它们的溶解性。DCDR 技术也用于测定肽磷酸化。6使用偏最小二乘 (PLS) 方法量化磷酸化程度,预测误差为 2%。

在本研究中,使用 DCDR 技术评估小分子代谢物。生物系统中代谢物的分析提供了对系统代谢过程的详细了解。代谢紊乱在许多疾病的发生和发展中起着关键作用;因此,快速、非侵入性地测量代谢物以诊断疾病的早期发作对于疾病的早期干预和及时管理非常重要。例如,确定某种代谢物作为疾病的指标可以帮助监测疾病或治疗的进展。质谱 (MS) 和核磁共振波谱 (NMR) 7-8等分析技术是代谢物分析中使用的主要方法。9虽然 MS 更灵敏(通常为 1pg 水平)并且能够确定未知分子,但 NMR 生成的数据重现性高,易于量化。然而,由于光谱重叠,NMR 数据可能难以解释,尤其是在代谢物的低浓度水平下。人们对代谢物分析的兴趣日益增加,要求改进具有更高性能的分析技术。考虑到这一点,我们评估了 DCDR 光谱在代谢物分析中的应用。Pazderka等人描述了研究各种氨基酸的晶体、DCDR 和水溶液形式之间光谱差异的详细工作。10


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实验性的

使用拉曼光谱研究 L-谷氨酸(Sigma-Aldrich,G-1251)、DL-丙氨酸(Sigma-Aldrich,A-7502)和 L-乳酸钠(Sigma-Aldrich,365165)。制备不同浓度的溶液,每种溶液各取 10 μL 沉积在镀金基板上,在室温下蒸发。镀金基材 (CA 134) 购自 EMF Corporation (Ithaca, NY)。为每个样品收集沉积物上随机点的拉曼光谱。

所有测量均使用具有 1,200 个凹槽/mm 光栅的拉曼系统获得,该系统配备 633nm 氦氖激光器,样品功率约为 21mW。100X 物镜(Olympus,0.8 NA)用于将激光聚焦到样品上并收集散射的拉曼光。

结果和讨论

拉曼光谱的低检测灵敏度是生物医学应用中的一个挑战。在这项工作中,我们使用 DCDR 研究了三种代谢物溶液的检测限。图 1 中的白光图像显示了每种代谢物溶液蒸发后留在金基材上的残留物。如图所示,沉积在镀金基材上的代谢物 (10μL) 在干燥时不会产生咖啡环图案。然而,蒸发后留下的沉积物仍然能够产生拉曼光谱。

在这里,DCDR 已被用于从小分子代谢物获得高质量的拉曼光谱。图2描绘了从基底上沉积物的单个位置获得的三种不同浓度的 DL-丙氨酸、L-谷氨酸和 L-乳酸钠的拉曼光谱。尽管 10 mM 的丙氨酸和谷氨酸拉曼光谱和 1 mM 的乳酸溶液拉曼光谱看起来基本上像纯水,没有证据表明代谢物具有拉曼特征,但在这些浓度下从金基质上的沉积物中获得了代谢物的高质量 DCDR 光谱. 该技术显着扩展了拉曼光谱对小分子代谢物的浓度和小体积检测限。这些图说明了 300μM 溶液的可辨别拉曼特征。在 300μM 代谢物的光谱中观察到 853cm-1 处的尖峰。L-谷氨酸的光谱表明,100μM 溶液沉积物在 853cm-1 处没有产生峰,而在丙氨酸和乳酸的光谱中可见。图 2 中的初步拉曼光谱是从基板上的特定点收集的。

图 2:代谢物的 DCDR 谱。每个光谱都归一化为面积

为了得出决定性的结论,应该进行更多的研究,调查基底上沉积物的整个区域。然而,基于这里的初步结果,我们可以得出结论,DCDR 技术显着提高了所研究代谢物的拉曼光谱检测限。